pacbio如何使用Iso-Seq 3进行数据分析

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pacbio 三代全长转录组数据分析流程 Iso-Seq 3

Iso-Seq 建库

Iso-Seq的建库方案有如下三类：

1. 整个库都是一个样品的全长转录组，不需要加barcode区分样品

2. 不同样品的全长转录组，加上不同barcode ，可以放在一起进行建库测序

3. 一些靶向获得的部分基因也可以进行全长转录组的测序
   

Iso-Seq 3进行数据分析

Iso-Seq3 进行全长转录组的分析

1 ccs(Circular Consensus Calling)
ccs 获取一致性的序列，要求每一条测序的reads至少有一端含有引物序列。

ccs test.subreads.bam ccs.bam  --noPolish --minPasses 1

2 测序引物和barcode的去除
这一步是采用lima 来完成的，这个软件也是官方最新开发出来的程序，速度和准确度都较以往的算法有了很大的提升。还能够基于barcode序列区分不同的样品，

lima ccs.bam barcoded_primers.fasta  demux.ccs.bam --isoseq --no-pbi

3 聚类(cluster)
聚类采用IsoSeq3 软件来完成，这一步会首先将ployA尾巴去除掉，并将连环结构去除掉，再对相似的序列进行聚类，最好形成全长的reads。

isoseq3 cluster demux.primer_5p--primer_3p.bam  unpolished.bam --verbose

4 抛光(polish)
这一步主要是将聚类的转录本，合并成一个完整的一致性序列。

isoseq3 polish -j 16 unpolished.bam  test.subreads.bam   polished.bam

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